viernes, 3 de abril de 2009

camara de neubauer










Sangre

Recuento de eritrocitos

Recuento de eritrocitos: ejemplo
Observe que en la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes. Los glóbulos rojos se cuentan en las áreas coloreadas de rojo, mientras que los glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul. Ten en cuenta que la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x 1mm de área y 0.10 mm de profundidad. El factor de dilución es por tanto de 1:200. Convierte el número de glóbulos rojos contados en 5 cuadrados a nº glóbulos rojos/µl. (1 µl (microlitro) = 1 mm3 )
Como se hace?









































La imagen de abajo simula el campo que esta viendo al microscopio con un objetivo de 45x. Solo es visible el centro de la grilla. Intenta verificar esto al ir moviendo el campo de derecha-izquierda y de arriba-abajo, como si de una pletina de microscopio se tratase. Cuenta los glóbulos rojos en los cinco cuadrados mencionados anteriormente y determina el recuento de eritrocitos como se ha descrito anteriormente..
Muy importante: Cuando un eritrocito se sitúa en mitad de las líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado. Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de las líneas inferior y/o de la derecha..
El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente:
Mujeres:
3.9-5.6 millones/µl
Hombres:
4.5-6.5 millones/µl
Determine el recuento del sujeto cuya muestra aparece en la imagen.
Cual es la solución?








Técnicas de estudio de líneas celulares


TÉCNICAS DE CONTAJE
CELULAR
Una suspensión celular se caracteriza por
presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido.
Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en
la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables.
Para determinar la densidad de las células se
emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje
celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos
(cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el
"Cell Coulter" de la empresa target="_top">Beckman-Coulter.








El principio del contador celular se basa en la
medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando
una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un
pequeño orificio. Como se puede ver en el esquema, una pequeña abertura entre
los electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículas
que se encuentran en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio
desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido
como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al
volumen de la partícula. controlando la cantidad de la suspensión que
circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las
partículas. Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo,
independientemente de su forma, color y densidad.



En la unidad de Citometría de flujo y
Microscopia Confocal de los target="_top">Servicios
Científico-Técnicos
de la Universidad de Barcelona
se dispone de contadores celulares.
Sin
embargo
, es
posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos
basta con una cámara de contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y un
microscopio. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se
coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas
señales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el
microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede
determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.








La cámara de Neubauer es una cámara de contaje
adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata
de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual
se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve
en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos
lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos
está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre
con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el
volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.



Si contamos las cuatro áreas sombreada (L)
observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en
la suspensión celular será :
concentración en la suspensión (células / mL) =
10000 (x/4)








En la imagen puedes observar el aspecto de una
de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una
cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen
ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.









Existen numerosos modelos de cámaras de contaje
celular adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes observar una
cámara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas.





Para determinar la viabilidad celular se
emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán.
El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células
que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen en
la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar
células blancas, por exclusión, a células viables es un error pues por este
método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión,
determinando como inviables sólo aquellas con la membrana rota. Existen
otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso
de la tinción con ioduro de
propidio



En la red dispones de descripciones detalladas
sobre target="_top">como
utilizar un hemocitómetro
, como la propuesta por P.J. Hansen, o la detallada descripción que aporta
Beckton-Dickinson, y los problemas de cálculo de
parámetros celulares que plantea empleando datos obtenidos a partir de un
hemocitómetro, y otros protocolos
para el contaje de células (en protocol-online)
- arriba -



Material
docente diseñado y elaborado por Manuel Reina. Última actualización : 20/10/2003
10:25.
Comentarios : mreina@ub.edu







se
aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca al aire o con algodón. Se coge
entre el pulgar y el índice y se hace una punción rápida y penetrante a
través de la piel de la punta del dedo con una lanceta estéril.









2. Se deshecha la primera
gota de sangre y se aspira la siguiente con la pipeta de dilución
perfectamente limpia y seca hasta la señal 1 o 0.5 (también puede utilizarse
la pipeta de hemoglobina, de 20 microlitros). Hay que evitar la entrada de
burbujas de aire, pudiendo ayudarnos de un papel de filtro para conseguir el
enrasado.









3. A continuación se toma con
la pipeta líquido de Hayem, isotónico con la sangre, hasta la señal 1; así,
la sangre queda diluida al 1/10, si tomamos sangre hasta la señal 1, o al
1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el volumen de la bola de la
pipeta es 100 veces superior al del capilar de la misma. (Si hemos utilizado
la pipeta de hemoglobina podemos diluir su contenido en 2 o 4 ml de líquido
de Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).









4. Tomamos la pipeta (o el
tubo de ensayo) entre los dedos índice y pulgar y agitamos. A través de la
goma de conexión con la pipeta, soplamos para despreciar las primeras gotas
por corresponder al líquido que estaba en el capilar.









5. Se adapta un cubreobjetos
sobre una cámara cuentaglóbulos limpia y seca y se coloca una gota en uno de
los lados del cubre; esta gota penetra por capilaridad y rellena el retículo
de la misma.









6. Una vez preparada la
cámara se coloca sobre la platina del microscopio dejándose unos minutos en
reposo para que sedimenten los glóbulos. Disponemos el condensador bajo y luz
débil; enfocamos primero con el objetivo débil seco y luego se cambia al
fuerte seco para proceder al recuento, que se lleva a cabo en los cuadrados
pequeños del retículo marcado en color rojo. Finalizado el recuento se
procede a la limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua destilada y
alcohol-éter sucesivamente.









7.El volumen de sangre en el
cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la
cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número
de cuadrados contados.
Con cámara de NEUBAUER: Superficie de 1
cuadrado grande (1/20 mm de lado):



Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de
profundidad):



Si contamos "a" glóbulos rojos en
"n" cuadrados pequeños, el número de glóbulos por cuadrado será
a/n.
Si en un volumen 1/4000 mm3 hay a/n
glóbulos rojos, en 1 mm3 habrá X. Luego:



siendo X el número de glóbulos rojos existentes
por cada mm3 de sangre diluida.
Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200,
habrá que multiplicar el valor X por 100 o 200 respectivamente, con lo cual
obtendremos un nuevo valor, Y, que representa el número de glóbulos rojos
existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).








Se utilizan para calcular, mediante el uso del
microscopio, el número de partículas (leucocitos, hematíes, bacterias…) por
unidad de voluimen de un líquido.
La cámara está constituida por
una placa base de vidrio especial pareciso a un porta, su parte central se
encuentra separada de los extremos por unas ranuras. en ella se encuentran las
cuadrículas de recuento.
La fórmula de contaje es:
partículas/mm3= partículas contadas.
Clases de cámaras:
- Neubauer improved: Es el más
utilizado (9 cuadros grandes, cada 1 de 1 mm2.)
- Neubauer: La diferencia es
el cuadro grande central.
- Thoma: Se utiliza solo para
el recuento de eritrocitos.
- Fuchs-Rosenthal: Se utiliza




habitualmente para recuento de células en líquidos orgánicos (LCR, Líquido
sinovial…)

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